冰凍切片觀察凋亡IFtunel+IF雙標實驗步驟-上海鄭核

一、實驗器材及試劑

1、實驗器材

名稱 廠家 型號

冰凍切片機 Thermo Cryotome E

載玻片 Servicebio

蓋玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 10212432C

脫色搖床 Servicebio TSY-B

渦旋混合器 Servicebio MX-F

掌上離心機 Servicebio D1008E

移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573

組化筆 Gene tech GT1001

冰箱 青島海爾股份有限公司 BCD-192TGN

正置熒光顯微鏡 日本尼康 Nikon Eclipse C1

成像系統 日本尼康 Nikon DS-U3

2、主要實驗試劑

試劑 廠家 貨號

丙酮 國藥集團化學試劑有限公司

PBS緩沖液 Servicebio G0002

蛋白酶K Servicebio G1205

破膜液 Servicebio G1204

BSA Servicebio G5001

Tunel試劑盒 Roche 11684817910

一抗

熒光二抗

DAPI Servicebio G1012

抗熒光淬滅封片劑 Servicebio G1401

二、冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育25min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、加試劑1,2：按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合（試劑1,2為現配現用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。

5、BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）。

三．冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標結果判讀

DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，Roche試劑盒為FITC熒光素標記，陽性凋亡細胞核為綠色，一抗標記的陽性細胞為紅色

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