冰凍切片免疫組化抗原抗體結(jié)合檢測蛋白-上海鄭核
一、實驗器材及試劑
1、實驗器材
名稱 廠家 型號
冰凍切片機 Thermo Cryotome E
載玻片 Servicebio
蓋玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 10212432C
微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司 P70D20TL-P4
脫色搖床 Servicebio TSY-B
渦旋混合器 Servicebio MX-F
掌上離心機 Servicebio D1008E
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
組化筆 Gene tech GT1001
冰箱 青島海爾股份有限公司 BCD-192TGN
顯微鏡 CIC XSP-C204
2、主要實驗試劑
試劑 廠家 貨號 稀釋比
OCT包埋劑 Sakura 4583
無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司
二甲苯 國藥集團化學試劑有限公司
EDTA（PH8.0)抗原修復液 Servicebio G1206
EDTA(PH9.0)抗原修復液 Servicebio G1203
檸檬酸（PH6.0)抗原修復液 Servicebio G1202
PBS緩沖液 Servicebio G0002
4%多聚甲醛 Servicebio G1101
3%雙氧水 Servicebio G0115
BSA Servicebio G5001
正常兔血清 Servicebio G1209
蘇木素染液 Servicebio G1004
蘇木素分化液 Servicebio G1309
蘇木素返藍液 Servicebio G1340
中性樹膠 Servicebio G1403
一抗：
二抗：
組化試劑盒DAB顯色劑 Servicebio G1211
二、冰凍切片免疫組化實驗步驟
1、冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于4%多聚甲醛固定10min，于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
2、抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。中低火10-15min，斷電間隔10min轉(zhuǎn)至中低火10-15min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定）
3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）
5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加組化試劑盒內(nèi)與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
7、DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。
8、復染細胞核：蘇木素復染3min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。
9、脫水封片：將切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min --無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
10、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。
三、冰凍切片免疫組化實驗結(jié)果判讀
蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。
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